Órfão desde muito cedo, Peter Parker (Tobey Maguire) foi criado em Queens, Nova Iorque, pela tia Mary e o tio Ben. Parker é um aluno aplicado, trabalha como fotógrafo no "Daily Bugle" e diverte-se com o colega e melhor amigo Harry Osborn. Tímido, passa também metade do dia a suspirar pela bela Mary Jane Watson (Kirsten Dunst). Durante uma visita de estudo, em que Peter e os colegas assitem a uma demonstração científica com aranhas, Peter é mordido por um espécime que fora manipulado geneticamente. Pouco tempo depois, descobre que adquiriu estranhos poderes: tem a força, a agilidade e os sentidos aguçados de uma aranha! Quando um ladrão assassina o tio Ben, Parker transforma-se em Homem-Aranha e captura o delinquente. A partir daí, recordando uma frase do tio - "um grande poder implica uma grande responsabilidade" - o tímido adolescente resolve utilizar os seus poderes para combater o crime. Oportunidade que se proporciona, quando o pai de Harry, Norman Osborn (Willem Dafoe) se transforma em Green Goblin após uma experiência científica que aumentou a sua inteligência e força, mas também o enlouqueceu. Goblin será o maior inimigo de Parker e o super-herói terá de o vencer para salvar a Humanidade - e também a bela Mary Jane, que sucumbirá aos encantos da dupla Parker/Homem-Aranha.